Validation of an analytical method by high-performance liquid chromatography and microbiological assay, biological safety and in silico toxicity for danofloxacin

Danofloxacin is a veterinary fluoroquinolone used to treat respiratory and gastrointestinal diseases of birds, pigs and cattle. The literature reviewed shows some analytical methods to quantify this fluoroquinolone, but microbiological and biological safety studies are limited. The analytical methods were validated by the Official Codes. The LC-DAD method was developed and validated using an RP-18 column, mobile phase containing a mixture of 0.3% triethylamine (pH 3.0) and acetonitrile (85:15, v/v). The microbiological assay was performed by agar diffusion method (3 x 3) and Staphylococcus epidermidis as a microorganism test. Forced degradation studies were performed in both methods. The minimum inhibitory concentration (MIC) was performed by test microdilution and toxicity studies were evaluated using in silico study, cell proliferation, cell viability test, micronuclei and comet assay. LC and a microbiological assay proved linear, accurate, precise, and robust to quantify danofloxacin, but only the LC method showed selectivity to quantify the drug in the presence of its degradation products. These results demonstrate that the LC method is suitable for stability studies of danofloxacin, but a microbiological assay cannot be used to quantify the drug due to the biological activity of the photoproducts. Ex-vivo cytotoxicity and theoretical and experimental genotoxicity were also observed.

Sixteen years o Pityriasis Versicolor in metropolitan area of Porto Alegre, Southern Brazil / Dezesseis anos de Pitiríase Versicolor na Região Metropolitana de Porto Alegre, Sul do Brasil

SUMMARYPityriasis versicolor is the most common of the diseases caused by Malasseziayeasts. The aim of this study is to determine the prevalence of pityriasis versicolor and its etiological aspects in the metropolitan area of Porto Alegre, Brazil. A retrospective crosssectional study with data from patients of a reference hospital from 1996 to 2011 was performed. Collected data included: date, age, gender, ethnicity, anatomical region of lesion and the direct mycological examination results. Among the positive results in the direct mycological examination, 5.8% (2,239) were positive for pityriasis versicolor. The angular coefficient (B) was -0.3%/year, showing a decrease over the years. The disease was more prevalent in men (7.1% of men versus 5.1% of women that underwent the direct mycological examination); younger age (median 31 years old); "pardo" and black people (3.7% more than expected in the sample); trunk (73.44% of the affected anatomic sites). Lesions in rare sites (groin, genitals, legs, feet and hands) were also observed in this study. In conclusion, due to the decrease in the prevalence of pityriasis versicolor, long-term epidemiological studies in the metropolitan area of Porto Alegre, Brazil, are needed to continue the monitoring of this disease.

RESUMOPitiríase versicolor é a mais comum das doenças causadas pelas leveduras do gênero Malassezia. O objetivo do trabalho foi determinar a prevalência de pitiríase versicolor e seus aspectos etiológicos na região metropolitana de Porto Alegre, Brasil. Foi realizado um estudo retrospectivo transversal com dados de pacientes de hospital de referência entre 1996 a 2011. Os dados coletados foram: data, idade, gênero, etnia, local anatômico da lesão e resultados do exame micológico direto. Dentre os resultados positivos do exame micológico direto, 5,8% (2.239) foram positivos para pitiríase versicolor. O coeficiente angular (B) foi -0,3%/ ano, mostrando uma diminuição ao longo dos anos. A doença foi mais prevalente em homens (7,1% dos homens versus 5,1% das mulheres que se submeteram ao exame micológico direto); jovens (mediana de 31 anos); pardos e pretos (3,7% acima do esperado para a amostra); tronco (73,4% dos locais anatômicos afetados). Lesões em locais raros (virilha, genitálias, pernas, pés e mãos) também foram observadas no estudo. Em conclusão, devido à diminuição da prevalência de pitiríase versicolor, estudos epidemiológicos de longo prazo são necessários para continuar o monitoramento da doença na região metropolitana de Porto Alegre, Brasil.

APPLICATION OF 6-NITROCOUMARIN AS A SUBSTRATE FOR THE FLUORESCENT DETECTION OF NITROREDUCTASE ACTIVITY IN Sporothrix schenckii / Aplicação de 6-nitrocumarina como substrato fluorescente para detecção de atividade nitroredutásica em Sporothrix schenckii

Introduction Sporothrix schenckii is a thermal dimorphic pathogenic fungus causing a subcutaneous mycosis, sporotrichosis. Nitrocoumarin represents a fluorogenic substrate class where the microbial nitroreductase activity produces several derivatives, already used in several other enzyme assays. The objective of this study was the analysis of 6-nitrocoumarin (6-NC) as a substrate to study the nitroreductase activity in Sporothrix schenckii. Methods Thirty-five samples of S. schenckii were cultivated for seven, 14 and 21 days at 35 °C in a microculture containing 6-nitrocoumarin or 6-aminocoumarin (6-AC) dissolved in dimethyl sulfoxide or dimethyl sulfoxide as a negative control, for posterior examination under an epifluorescence microscope. The organic layer of the seven, 14 and 21-day cultures was analyzed by means of direct illumination with 365 nm UV light and by means of elution on G silica gel plate with hexane:ethyl acetate 1:4 unveiled with UV light. Results All of the strains showed the presence of 6-AC (yellow fluorescence) and 6-hydroxylaminocoumarin (blue fluorescence) in thin layer chromatography, which explains the green fluorescence observed in the fungus structure. Conclusion The nitroreductase activity is widely distributed in the S. schenckii complex and 6-NC is a fluorogenic substrate of easy access and applicability for the nitroreductase activity detection. .

Introdução Sporothrix schenckii é um fungo dimórfico térmico, agente etiológico de micose subcutânea, a esporotricose. Nitrocumarina representa classe de substratos fluorogênicos em que a atividade nitroredutásica microbiana produz vários derivados, já utilizados em vários outros ensaios enzimáticos. O objetivo deste estudo foi analisar 6-nitrocumarina (6-NC) como substrato para estudo da atividade nitroredutásica em Sporothrix schenckii. Métodos Trinta e cinco isolados de S. schenckii foram cultivados por sete, 14 e 21 dias a 35 °C em um microcultivo contendo 6-nitrocumarina ou 6-aminocumarina (6-AC) solubilizada em dimetilsulfóxido ou dimetilsulfóxido como controle negativo, para posterior análise em microscópio de epifluorescência. A fase orgânica da cultura de sete, 14 e 21 dias foi analisada por meio de iluminação direta com luz UV de 365 nm e por eluição em placas de sílica gel G com hexano:acetato de etila 1:4 e revelada com luz UV. Resultados Todos os isolados mostraram a presença de 6-AC (fluorescência amarela) e 6-hidroxilaminocumarina (fluorescência azul) em cromatografia em camada delgada, que explica a fluorescência verde observada na estrutura dos fungos. Conclusão A atividade nitroredutásica é amplamente distribuída no complexo S. schenckii e 6-NC é um substrato fluorogênico de fácil obtenção e aplicabilidade para detecção da atividade nitroredutásica. .

Comparison between two culture media for in vitro evaluation of antifungal susceptibility of the Sporothrix schenckii complex / Comparação entre dois meios de cultura para avaliação in vitro da suscetibilidade a antifúngicos do complexo Sporothrix schenckii

BACKGROUND: The standard methodology for determining the antifungal sensitivity against the Sporothrix schenckii complex recommends the use of the 1640 Roswell Park Memorial Institute culture medium (RPMI) buffered with morpholinepropanolsulfonic acid (MOPS). However, while this is a high-cost medium which requires a laborious implementation and sterilization by filtration, the Sabouraud dextrose broth is a low-cost medium, widely used in mycology, sterilized by autoclave. OBJECTIVE: To evaluate the performance of the Sabouraud dextrose broth culture medium as a substitute for the RPMI 1640-MOPS in determining the antifungal sensitivity of S. schenckii. METHODS: Forty-eight clinical isolates were evaluated against five antifungal agents: itraconazole, ketoconazole, fluconazole, amphotericin B and terbinafine, using the method of broth microdilution advocated by the M38-A2 protocol of the Clinical and Laboratory Standards Institute. RESULTS: There were no significant differences between the Minimum Inhibitory Concentrations obtained in the two culture media for all the antifungals, with the exception of the amphotericin B. Regarding this drug, the Minimum Inhibitory Concentration range obtained were wider for the Sabouraud dextrose broth than for the Roswell Park Memorial Institute morpholinepropanelsulfonic acid. CONCLUSIONS: The Sabouraud dextrose broth showed potential to be used in the in vitro evaluation of the S. schenckii complex antifungal activity.

FUNDAMENTOS: A metodologia padronizada para a determinação da sensibilidade aos antifúngicos frente ao complexo Sporothrix schenckii preconiza a utilização do meio de cultura Roswell Park Memorial Institute (RPMI) 1640 tamponado com ácido morfolinopropanosulfônico (MOPS). No entanto, este meio possui custo elevado, execução trabalhosa e esterilização por filtração. Já o caldo Sabouraud-dextrose é amplamente utilizado em micologia, de baixo custo e pode ser esterilizado por autoclavagem. OBJETIVO: Avaliar o desempenho do meio de cultura caldo Sabouraud-dextrose em substituição ao RPMI 1640-MOPS na determinação da sensibilidade de S. schenckii a antifúngicos. MÉTODO: Foram avaliados 48 isolados clínicos frente a cinco antifúngicos: itraconazol, cetoconazol, fluconazol, anfotericina B e terbinafina, utilizando a metodologia da microdiluição em caldo preconizada pelo protocolo M38-A2 do Clinical and Laboratory Standards Institute. RESULTADOS: Não houve diferenças significativas nas Concentrações Inibitórias Mínimas obtidas nos dois meios de cultura para todos os antifúngicos, com exceção da anfotericina B. Para este fármaco, foram obtidas faixas mais amplas de Concentrações Inibitórias Mínimas para caldo Sabouraud-dextrose do que para Roswell Park Memorial Institute-morfolinopropanosulfônico. CONCLUSÕES: O caldo Sabouraud-dextrose mostrou potencial para ser utilizado na avaliação in vitro da atividade antifúngica do complexo S. schenckii.

Perfil de suscetibilidade a antifúngicos de dermatófitos isolados de pacientes com insuficiência renal crônica / Antifungal susceptibility of dermatophytes isolated from patients with chronic renal failure

FUNDAMENTOS: As dermatofitoses apresentam alta prevalência na população em geral e, principalmente, em pacientes com insuficiência renal crônica, necessitando tratamento com antifúngicos tópicos e/ou sistêmicos, cuja eficácia precisa ser avaliada. Estudos in vitro para avaliar a ação de antifúngicos são raros, especialmente, em fungos filamentosos. OBJETIVO: Avaliar o perfil de suscetibilidade de diferentes espécies de dermatófitos, isolados de pacientes com insuficiência renal crônica, em relação a nove antifúngicos disponíveis comercialmente para o tratamento de dermatofitoses. MÉTODO: Analisaram-se 26 isolados de dermatófitos de pacientes com insuficiência renal crônica em relação a nove antifúngicos (cetoconazol, ciclopirox olamina, fluconazol, griseofulvina, itraconazol, miconazol, piroctona olamina, terbinafina e tioconazol) pelo método de microdiluição em caldo proposto pelo Clinical and Laboratory Standards Institute (CLSI), com modificações para dermatófitos. RESULTADOS: Entre os antifúngicos testados, a terbinafina e o tioconazol obtiveram os melhores resultados de sensibilidade e o fluconazol apresentou baixa atividade, especialmente para as amostras da espécie M. gypseum. O ciclopirox olamina, apesar de menos eficaz que a terbinafina, também mostrou resultados satisfatórios. CONCLUSÕES: De modo geral, o perfil de sensibilidade dos antimicóticos testados seguiu o padrão de resultados mostrados por estudos anteriores, ratificando a necessidade de conhecimento da espécie causadora de dermatofitose, devido à variação do perfil de suscetibilidade entre as espécies. Além disso, nossos resultados demonstram a importância da realização de ensaios de sensibilidade in vitro, pois alguns isolados da mesma espécie apresentaram diferente perfil de sensibilidade.

BACKGROUND: The prevalence of dermatophytosis in the general population is high, particularly in patients with chronic renal failure. Treatment requires the use of topical and/or systemic antifungal drugs. The efficacy of antifungal agents for the treatment of dermatophytosis has yet to be evaluated. Studies evaluating the in vitro activity of antifungal agents are rare, particularly in filamentous fungi. OBJECTIVE: To evaluate the susceptibility profile of different species of dermatophytes isolated from patients with chronic renal failure to nine antifungal drugs available on the market for the treatment of dermatophytosis. METHODS: Twenty-six isolates of dermatophytes obtained from patients with chronic renal failure were analyzed with respect to their susceptibility to nine antifungal agents (ketoconazole, ciclopirox olamine, fluconazole, griseofulvin, itraconazole, miconazole, piroctone olamine, terbinafine and tioconazole), using the broth microdilution method proposed by the Clinical and Laboratory Standards Institute (CLSI) and adapted for dermatophytes. RESULTS: Of the antifungal agents tested, the best results in terms of sensitivity were found with terbinafine and tioconazole, while the antifungal activity of fluconazole was found to be weak, particularly against strains of M. gypseum. Ciclopirox olamine, although less effective than terbinafine, also yielded satisfactory results. CONCLUSIONS: In general, the sensitivity profile of the antifungal agents tested in this study was similar to results obtained in previous studies, confirming the need to determine which species is causing the dermatophytosis given that antifungal susceptibility varies from one species to another. Furthermore, the present findings show the importance of conducting in vitro sensitivity tests, since the sensitivity profile may differ among isolates of the same species.

Sucesso terapêutico da terbinafina em um caso de esporotricose / Successful treatment of terbinafine in a case of sporotrichosis

A esporotricose é uma infecção subaguda ou crônica, causada por fungos pertencentes ao Complexo Sporothrix. Relato do caso: esporotricose de localização nasal foi tratada com iodeto de potássio e como não se obteve sucesso, reiniciou-se o tratamento com associação de iodeto de potássio e itraconazol. Porém, ocorreu nova recidiva. As culturas dos exames micológicos foram submetidas a ensaios de atividade antifúngica in vitro para auxiliar no tratamento. A terbinafina foi o antifúngico que apresentou melhores resultados, por isso, o tratamento foi reiniciado com este antifúngico e, após dois anos do término do mesmo, não recidivou. Adicionalmente, ambas as culturas foram comparadas por RAPD, obtendo padrões de fragmentos distintos, indicando que os isolados são diferentes ou demonstrando um processo microevolutivo do microrganismo.

Sporotrichosis is a chronic subacute infection caused by fungi belonging to the Sporothrix Complex. In the present clinical case, nasal sporotrichosis was treated with potassium iodide. This was unsuccessful, and the treatment was restarted with a combination of potassium iodide and itraconazole. This however resulted in a further recurrence of the infection. The mycological cultures were tested in vitro for antifungal activity to assist in treatment. Terbinafine, an antifungal drug, produced the best results and was therefore used for the rest of the treatment course, with no recurrence after two years of its completion. In addition, both cultures were compared using RAPD and different fragment patterns were observed. This indicated that the isolates were either different or indicated a microevolutionary process of this microorganism.

Microbiological evaluation of peracetic acid for disinfection of acrylic resins / Avaliação microbiológica de ácido peracético na desinfecção de resinas acrílicas

PURPOSE: The aim of this study was to assess the efficacy of peracetic acid (PAA) for the disinfection of dental acrylic resins experimentally contaminated with Candida albicans, Escherichia coli, Staphylococcus aureus and Pseudomonas aeruginosa. METHODS: Fifteen materials were used for each type of resin (thermosetting, self-curing and microwave-curing). Each material was placed in a test tube containing culture medium with a suspension of each microorganism and then incubated. The materials were rinsed and transferred to other tubes containing 50 mL of water for 5 min, 0.2 percent peracetic acid for 5 min or glutaraldehyde for 30 min. The materials were placed in the culture agar and incubated. Microbial growth was determined by colony counting after plating. RESULTS: Candida albicans growth was inhibited by peracetic acid and glutaraldehyde treatments. The number of colonies on resins treated with saline was greater than 10(5) CFU/mL. In resins infected with E. coli, S. aureus and P. aeruginosa the colony growth was not inhibited by saline and peracetic acid, but it was totally inhibited by glutaraldehyde. CONCLUSION: Surface disinfection using peracetic acid effectively inhibited C. albicans growth on all acrylic resins.

OBJETIVO: O objetivo deste estudo foi avaliar a eficácia do ácido peracético (PAA) na desinfecção de resinas acrílicas dentais experimentalmente contaminadas com Candida albicans, Escherichia coli, Staphylococcus aureus e Pseudomonas aeruginosa. METODOLOGIA: Quinze corpos de prova (CP) foram utilizados para cada tipo de resina (termopolimerizáveis, autopolimerizáveis e ativados por energia de micro-ondas). Cada CP foi colocado em um tubo teste com meio de cultura contendo uma suspensão de cada microrganismo e incubado. Posteriormente, os CP foram lavados e transferidos para outros tubos contendo 50 mL de água por 5 minutos, em 0,2 por cento de ácido peracético por 5 min ou em glutaraldeído por 30 minutos, plaqueados em ágar de cultura e incubados. O crescimento microbiano foi determinado por contagem de colônias após o plaqueamento. RESULTADO: O crescimento de Candida albicans foi inibido nos tratamentos com ácido peracético e glutaraldeído. O número de colônias nas resinas tratadas com solução salina foi superior a 10(5) UFC/mL. Nas resinas infectadas com E. coli, S. aureus e P. aeruginosa, o crescimento das colônias não foi inibido nas resinas tratadas com salina e ácido peracético, mas foi totalmente inibida pelo glutaraldeído. CONCLUSÃO: A desinfecção com ácido peracético inibiu efetivamente o crescimento de C. albicans em todas as resinas acrílicas.